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中国农业科学

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中国农业科学Scientia Agricultura Sinica收稿日期
基金项目:国家自然科学基金资助项目和辽宁省自然科学基金资助项目榄香烯复合抗肿瘤疫苗免疫的效应机制金梅、白雪, 胡景慧(辽宁师范大学生命科学院, 大连
摘要:以小鼠H22腹水型肝癌和L615白血病为实验模型,采用榄香烯或和热休克等为应激原(stressor),对小鼠H22腹水型肝癌细胞和L615白血病细胞进行不同浓度榄香烯,不同时间热休克处理,用透射电镜观察肿瘤细胞的形态变化;采用直接免疫荧光法流式细胞术(FCM)检测肿瘤细胞凋亡百分率及对肿瘤细胞膜HSP70,HSP90表达的影响;进而分离纯化不同应激原(榄香烯,丝裂霉素-C)诱导的H22和L615肿瘤细胞的HSP70-肽复合物,并用之免疫Balbc和615小鼠,进行体内抗瘤免疫效应的研究.透射电镜显示、榄香烯或热休克处理都能引起2种肿瘤细胞的凋亡和坏死,L615白血病细胞较H22肝癌细胞更敏感,形态学变化更剧烈;流式细胞术检测进一步证明,榄香烯与热休克都能诱导2 种肿瘤细胞发生凋亡,两者复合作用更能促进肿瘤细胞的凋亡,在一定范围内L615细胞凋亡与榄香烯的浓度和热休克的时间呈明显的依赖关系;用榄香烯或MMC诱导的2种肿瘤细胞分离纯化的HSP70-肽复合物给Balbc 和615 小鼠进行主动免疫、免疫组小鼠在1 个月内全部存活.而bufferD免疫对照组小鼠无一存活.
关键词: 榄香烯; 凋亡; 热休克蛋白;抗肿瘤疫苗Immunity Effects Mechanism Treated with Elemene-Combo Tumor VaccineJIN Mei,BAI Xue, HU of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian
Abstract: The possible relationship between heat shock protein (HSP) and the molecular mechanisms of active immunizationof elemene-combo tumor cell vaccine (TCV) was tudied by using murine H22 ascitic hepatic carcinoma and L615 leukemia as models. Stressors, such as elemene orand heat shock, were applied to study the following items: treated with of elemene and different time course of heat shock, transmission electron microscopy were used to observe influence on tumor cells. Direct flow cytometry (FCM) was used to detect the apoptotic rate ofH22 and L615 tumor cells and influence on the expression of membrane HSP70 and HSP90. The membrane HSP70-peptide complexwas separated and purified from H22 and L615 tumor cells induced by different stressors (elemene, MMC) and invivo active experiment was carried out using those isolated HSP70-peptide complex against H22 on Balbc miceand L615 on 615 mice. Under transmission electron microscope, the influence of elemene or heat shock on the two kinds of tumorcells is, to some extent, the same or almost the same, which means the apoptosis and necrosis of the cells. The extent of the influenceon the two kinds of tumor cells is different, and L615 leukemia was more sensitive and undergoing bigger morphological changesthan H22 hepatic carcinoma. Its further proved by FCM that both elemene and heat shock alone can induce the apoptosis of miceH22 hepatic carcinoma or L615 leukemia cells, with the intensifying of this effect by combining use of the two, the apoptosis of cellsand purifying Balbc and 615 mice immunized by HSP70-peptide compound of H22 and L615 tumor cell induced by elemene orMMC, the results showed that all mice survived within one month, while none of the mice in control immunized by
Key words: Elemene; Apoptosis; Heat shock protein; Tummor vaccine
1380 中国农业科学37卷榄香烯(elemene)不仅对肿瘤细胞具有明显的直接细胞毒作用,而且能提高肿瘤细胞的免疫原性,诱导机体主动免疫、有抗瘤效应[1;热休克使细胞热休克蛋白(heat shock protein, HSP)合成增加,热休克蛋白的主要功能是增加细胞对致死性刺激的防御和适应能力[2, 3,HSP在抗肿瘤免疫特别是主动特异性免疫应答中有重要作用[4~8.动物疫苗在畜牧养殖业上具有广泛的应用前景.为研究榄香烯复合抗肿瘤细胞疫苗主动免疫抗瘤效应及其分子机制,特别是与热休克蛋白之间的关系,笔者对榄香烯或和热休克作用后肿瘤细胞的凋亡和坏死生物学特性,榄香烯复合瘤苗诸因素单独或复合作用对肿瘤细胞膜热休克蛋白(HSP70,HSP90)表达的影响进行了检测,并用榄香烯和MMC处理后H22,L615肿瘤细胞的HSP70 肿瘤复合物肽,进行体内主动免疫试验、观察其免疫保护效应.为动物疫苗在畜牧业中的合理使用提供科学依据.
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物和瘤株Balbc近交系小鼠(H-2d)和小鼠腹水型肝癌H22(H-2-)高淋巴转移亚系[9,615近交系小鼠(H-2k)和L615白血病-615系小鼠的1株T淋巴细胞性白血病、由津638病毒诱发,用细胞在615系小鼠上同系移植建株而成[10.上述动物和瘤株引进后均在本室按常规进行繁殖传代,保种.小鼠体重20~26 g,性别不拘.
1.1.2 肿瘤细胞悬液的制备H22 腹水肝癌细胞由常规腹腔传代保种.接种后12~16 d抽取H22腹水瘤细胞,离心、洗涤后用RPMI 1640全培养调至试验所需细胞浓度.L615白血病细胞则按常规取接种后5~6d的L615白血病小鼠脾,置尼龙网上用注射器针芯在Hanks液中研磨,用120目尼龙网过滤,1 500 rmin离心5 min,去上清、打匀细胞,Hanks液洗3次,再用全培基调细胞至适当浓度,即得L615白血病细胞悬液.
1.1.3 药品、试剂和仪器1%榄香烯注射液,MMC和RPMI 1640 全培基.5%PI(碘化丙啶)染料(Sigma),APO2.7 单抗及德国BOEHRINGER 提供的细胞凋亡检测用Kit,DNA荧光染液(Coulter公司)、小牛血清为杭州四季青生物工程材料公司产品、其余为进口试剂或国产分析纯试剂.兔抗人HSP90多克隆抗体(中国医学科学院肿瘤研究所黄常志教授赠),FITC 标记的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG(北京中山生物制品有限公司)、小鼠抗HSP70单克隆抗体(美国ABR公司)、抗小鼠碱性磷酸酶-BCIPNBT 试剂盒(美国NEOMARKER 公司)、碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG(中科院上海生物化学研究所).常规电泳试剂;纤维素膜(NC,Hybond-c, Amersham, Life Science);分子量Marker(Sigma);考马斯亮蓝染色液(R 250).CO2培养箱(Model 2300,Sheldon),流式细胞仪(美国,COULTEREPICS XL型),电镜(日产型超薄切片机(美国).电泳仪,转膜电泳仪(LKBNOVABLOT, BROMMA, Pharmacia),超速离心机美国产),SHB-III循环水式多用真空泵等.
1.2 方法
1.2.1 透射电镜观察经不同处理后肿瘤细胞的形态学变化[11]2种肿瘤细胞分别以20.0 g・ml-1榄香烯
处理(30min)或42℃处理(H22:1 h; Lmin),收集细胞,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3 次,以2.5%戊二醛和1%锇酸双固定,用Epon812常规方法包埋,制成半薄切片,甲苯胺蓝染色,光镜下定位、LKB-5 型超薄切片机切片,铀-铅双染色,观察,照相.
1.2.2 细胞凋亡的检测参照文献[12]采用直接免疫荧光法流式细胞术(flow cytometry, FCM)进行检
测.基本方法为:取榄香烯或和热休克处理后的2种肿瘤细胞每毫升106个,PBS洗2次,移入已硅化的.于室温下加100 g・ml-1毛地黄苷后加藻红素标记的APO 2.7单抗于流式细胞仪(EPISC XL,Coulter)上进行荧光检测,并给出相应的凋亡细胞百分率.测定前、均用Coulter标准荧光微球校准仪器,使HPCV

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