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茶叶科学

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茶叶科学~288Journal of Tea Science乌龙茶加工过程多糖的变化,组分分离及特性研究倪德江,陈玉琼,余志,张芸、谢笔钧,周继荣(华中农业大学茶学专业, 湖北武汉
摘要:在乌龙茶加工过程中、多糖含量以及组成多糖的中性糖,蛋白质含量呈递减趋势,从鲜叶至第2次摇青结束,下降幅度小,但第3次摇青后大幅度下降、而糖醛酸的变化较小;加工过程多糖清除・OH和自由基的趋势基本一致,呈现抛物线变化,活性最高峰出现在第2次摇青结束,多酚类保留量为85%左右可以作为制定乌龙茶加工过程高活性茶多糖的形成指标.采用纤维素和葡聚糖凝胶柱层析法分离纯化乌龙茶多糖,各级分中性糖,蛋白质,糖醛酸含量以及清除OH, 的作用有较大差异.获得的乌龙茶多糖主要组分OTPS2-1是富含糖醛酸和少量蛋白质的三元糖复合物,相对重均分子质量为8.877×104,糖基由半乳糖,葡萄糖,阿拉伯糖,岩藻糖和鼠李糖组成,其摩尔比为收稿日期修订日期
基金项目:国家自然科学基金湖北省自然科学基金(2002AB101)等资助
作者简介:倪德江男,博士、教授,博士生导师,主要从事茶叶加工化学及天然产物化学的教学与科研工作.
关键词:乌龙茶;多糖;分离纯化;理化性质;活性
中图分类号:S571.1; Q539 文献标识码:A 文章编号XChange of Polysaccharide During the Processing ofOolong Tea and its Structure De-jiang, CHEN Yu-qiong, YU Zhi, ZHANG Yun, XIE Bi-jun, ZHOU Agricultural University, WuhanChina)
Abstract: During the process of Oolong tea, the extraction rate of TPS and the contents of its neutral sugar andprotein decreased, particularly notably after the third shaking, but the content change of uronic acid was less. It wasalso indicated that the inhibiting effects of polysaccharide on radicals increased before the third shaking, and thendecreased on Zuoqing stage. According to the changes of polyphenol content, when it was retained 85, the contentof TPS was highest and the effect on scavenging OH and was best, which was regarded the technical index toend shaking during the process of Oolong tea. Four fractions of OTPS was obtained by DEAE-52 and there were obvious differences not only in contents of neutral sugar, uronic acid and protein ofOTPS, but also in inhibiting effects on hydroxyl radical ( OH) and superoxide anion radical . OTPS 2-1,amain fraction of OTPS, was obtained by DEAE-52 and Sephadex column It was found thatOTPS2-1 wasatrinal compound of polysaccharide containing rich uronic acid and less protein. The results alsoand Rha withamolar ratio of
Key words: Oolong tea, Separation, Activity国内外有关茶多糖的研究多集中在糖基组成,连接方式,分子量分布、理化性质以及降血糖等方面[1~4,而对加工过程多糖变化的研究尚无报道.笔者曾收集国内有代表性的绿O
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4期倪德江,等:乌龙茶加工过程多糖的变化,组分分离及特性研究283茶,乌龙茶,红茶,黑茶,白茶,将提取的TPS用于治疗四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠,结果表明半发酵乌龙茶,全发酵红茶以及后发酵黑茶的TPS的降血糖效果优于绿茶TPS[5.进一步选择湖北保康的福鼎大白茶,福建宜春的水仙以及云南思茅的大叶种鲜叶,分别制成绿茶,乌龙茶和红茶,研究其相应TPS特性和生物功能,结果表明多糖体外清除・OH和O2-的能力大小依次为乌龙茶>绿茶>红茶,而且在低,中等剂量下,乌龙茶,红茶TPS降低血糖的作用明显优于绿茶TPS[6.本文以乌龙茶为试材,探讨加工过程多糖的理化变化和活性变化,并对乌龙茶多糖的组分进行分离纯化,分析相应的特性变化.
1 材料与方法
1.1 试验材料与仪器Sephadex G-150,DEAE-52纤维素(Phamacia公司);核糖,岩藻糖,葡萄糖,咔唑,甘露糖,半乳糖,木糖,阿拉伯糖,考马斯亮蓝G-250(Sigma公司);其余试剂为国产分析纯.ALPHAL-2真空冷冻干燥机(德国);DLS-700 Otsuka Electronics激光光散射仪(日本);GC-9A Shimadzu气相色谱仪(日本);PCM液相色谱仪(美国Waters);其它设备为国产仪器.
1.2 试验设计及取样方法于2002年5月10日和7月5日分别采自华中农业大学山北福鼎大白茶茶园和湖北省果茶所大叶乌龙茶园茶叶,采摘标准为形成驻芽的1芽2叶.鲜叶进厂后充分混匀、然后按传统乌龙茶制作工艺加工成乌龙茶.在加工过程中、对鲜叶,萎凋叶,第1次摇青叶,第2次摇青叶,第3次摇青叶,第4次摇青叶,第5次摇青叶,杀青叶和干燥叶取样,蒸青固样
5 min,冷冻干燥.
1.3 乌龙茶多糖的提取采用水提乙醇沉淀法,具体方法见文献[7,得乌龙茶多糖粗品(COTPS).
1.4 乌龙茶多糖的分离纯化与纯度鉴定COTPS经Sevag法脱蛋白,过氧化氢脱色,透析,浓缩,冷冻干燥得脱蛋白乌龙茶多糖(OTPS-D).采用DEAE-52纤维素柱层析分级(层析柱φ2.6 cm×50 cm),得乌龙茶多糖和OTPS4级分.主要组分OTPS2采用Sephadex G-150柱层析分离(层析柱φ2.2 cm×50 cm),得到主要部分OTPS2-1.利用葡聚糖凝胶柱层析和琼脂糖凝胶电泳检验OTSP2-1的纯度.详细方法见文献[8.
1.5 乌龙茶多糖相对分子质量的测定采用凝胶渗透色谱和激光光散射联用仪(GPC-LLS)测定[9.仪器:DAWN DSP多角光散射仪,配置p100泵,TSK-GEL G6000PWXL柱(7.8 mm×300 mm)和示差折光检测器(RI-150).色谱柱温为25℃、流动相为
0.5 molL NaCl,流速为1.0 mlmin.所有的溶液都经过沙芯漏斗过滤,或用0.45 μm过滤器过滤.Astra软件用于数据处理.OTPS2-1用0.2 molLNaCl配制成2‰浓度,洗脱液为0.2 molLNaCl,流速1.0mlmin,色谱柱温为25℃、激光波长为632.8nm.
1.6 乌龙茶多糖糖基组成测定
多糖的水解及衍生:采用糖腈乙酸酯衍生物气相色谱法[10.取多糖样品10 mg置于安培管中、加入2.0 ml 2.0 molL三氟乙酸、真空封管后110℃水解2 h,冷却后以玻璃棉过滤,然后减压蒸干残余的三氟乙酸.在水解物中加入2 mg肌醇六乙酰酯作为内标物,分别加入
10 mg盐酸羟胺及1.0 ml无水吡啶,溶解后在90℃反应30 min,冷却至室温,加入1.0 ml无水醋酸酐,90℃水浴反应30 min,冷却后加入1.0 ml水搅拌、然后用氯仿萃取3次,合并茶叶科学25卷284氯仿层,减压抽干后加入1.0 ml氯仿溶解进行
气相色谱分析.色谱条件:OV-1701石英毛细管柱(0.32 mm×30 m),内径0.32μm;N2为载
气、流速50 mlmin,分流比为1:50,氢火焰离子化检测器,氢气0.6 kgcm2,空气0.5kgcm2;进样口温度为250℃、柱温采用程序升温,从0到5 min为190℃、然后以10℃min的速率升至230℃.根据峰面积计算单糖组成摩尔比.
1.7 氨基酸组成分析氨基酸组成分析采用HPLC法[11.仪器型号PCM测定方法依据Waters AccQ.Tag Chemistry Package, 在湖北省农科院测试中心进行.
1.8 多糖中性糖,糖醛酸以及蛋白质含量测定
中性糖:-蒽酮比色法[6;糖醛酸:硫
酸-咔唑法[6;蛋白质:考马斯亮蓝G-250法[6.
1.9 多糖清除自由基活性
对自由基的清除率:采用黄嘌呤氧化
酶法测定;对・OH自由基的清除率:采用D-脱氧核糖-Fe体系法[6.
2 结果与分析
2.1 乌龙茶加工过程多糖的变化
2.1.1 多糖提取率的变化利用适制乌龙茶的大叶乌龙品种、采摘形成驻芽的1芽2叶,加工成乌龙茶,并以绿茶品种福鼎大白茶作对比、分析加工过程多糖的含量变化,结果如表1,2所示.无论是大叶乌龙还是福鼎大白茶,多糖在加工过程中均呈递减趋势,从鲜叶至第2次摇青结束,多糖减少的幅度小,而第3次摇青后多糖大幅度下降、如大叶乌龙茶,第3次摇青多糖为3.24,而杀青为2.24,下降1.0.
2.1.2 多糖中中性糖,蛋白质,糖醛酸的变化两品种鲜叶加工过程多糖中中性糖,蛋白质,糖醛酸含量变化见表1,2.随着加工的进程,中性糖,蛋白质含量呈下降趋势,第3次摇青前下降幅度小,之后下降幅度大,这与多糖得率的变化一致.而糖醛酸的变化较小,相对比较稳定.表1 大叶乌龙茶加工过程多糖变化,多酚保留量以及清除自由基效果Table1Changes of TPS, amounts of retained polyphenols and Scavenging rate of・OH andduring the processing of DaYe Oolong tea清除率Scavenging rate 工序Process多糖(%)TPS中性糖(%)Neutral sugar蛋白质(%)Protein糖醛酸(%)Uronic acid茶多酚保留量(%)鲜叶Fresh leaves萎凋Withering
第1次摇青The 1st shaking
第2次摇青The 2nd shaking
第3次摇青The 3rd shaking
第4次摇青The 4th shaking
第5次摇青The 5th shaking杀青De-enzyming干燥Drying
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4期倪德江,等:乌龙茶加工过程多糖的变化,组分分离及特性研究285表2 福鼎大白乌龙茶加工过程多糖变化,多酚保留量以及清除自由基效果Table2Changes of TPS, amounts of retained polyphenols and Scavenging rate of ・OH andduring the processing of FuDingdabai Oolong tea清除率Scavenging rate工序茶多酚保留量%Retained polyphenols (NUml) OH(%)表3 OTPS各组分中性糖,蛋白质,糖醛酸含量及抗氧化作用Table3Contents of neutral sugars, protein and uronic acid in the various fraction of OPTSand their antioxidative activity清除率Scavenging rate 多糖级分OTPS
2.1.3 多糖清除・OH和自由基效果乌龙茶加工过程多糖对・OH和自由基的清除作用如表1,2所示.随着加工的进行、多糖清除・OH和能力逐渐增强、至第2次摇青结束时达到高峰,之后稍有下降、在杀青和干燥工序又有升高.从整个过程来看,鲜叶经过加工后体内多糖含量虽然下降、但活性已有明显的提高.乌龙茶加工过程多糖的变化及其清除自由基效果试验表明,多糖清除自由基能力与中性糖,蛋白质含量并无量效关系,提示加工过程多糖结构的改变可能对生物活性产生了较大影响.此外,从两品种鲜叶加工乌龙茶来看,福鼎大白茶加工过程多糖清除两种自由基的能力要比大叶乌龙茶强、这可能与两品种的栽培、环境和采摘条件有关.通过对乌龙茶加工过程茶多酚含量进行动态分析,得到各工序茶多酚的保留量,结果见表3.在第2次摇青结束时,多酚类保留量为85%左右,其茶叶科学25卷286后保留量大幅度下降、提示多酚类的变化与多糖含量的变化趋势一致,多酚类保留量为85%左右可以作为制定乌龙茶加工过程高活性茶多糖的形成指标.
2.2 乌龙茶多糖的组分分离采用DEAE-52纤维素柱层析法对脱蛋白和脱色后的乌龙茶多糖进行分离,经水,0.1molL NaCl,0.2 molL NaCl和0.5 molL NaCl溶液梯度洗脱后得到4个级分,即洗脱曲线如图1.各级分经减压浓缩,透析后冷冻干燥,得率分别为%和0.73.尽管OTPS3,OTPS4组分清除・OH和能力强于OTPS2(表3),但由于PTPS1,OTPS3和OTPS4得率较低,本文仅对OTPS2作进一步研究.OTPS2用少量0.1 molL NaCl溶液溶解后上Sephadex G-150层析柱,用0.1 molL NaCl溶液洗脱,得到OTPS2-1和OTSP2-2两个级分,洗脱曲线见图2.OTPS2-1和OTPS2-2得率分别为OTPS2总多糖的50%和10,OTPS2-1是OTPS2的主要组成部分.
2 洗脱管数The number of tube
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280,490nm 吸收值Absorption atnm糖吸收峰蛋白质吸收峰图1 乌龙茶多糖在DEAE-52柱上的洗脱曲线Fig.1Elution curve of OTPS on DEAE-52 cellulose column洗脱管数Number of tube
208,490nm吸收值Absorpttion atnmTube number糖吸收值蛋白质吸收值图2 OTPS2在Sephades G-150柱上的洗脱曲线Fig.2Elution curve of OTPS2 on sephadex G-150column^kaFf

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