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基于无毒基因序列的稻瘟病菌指纹类型与致病型的关系初...

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基于无毒基因序列的稻瘟病菌指纹类型与致病型的关系初探王建飞鲍永美李培富张红生;;
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摘要:基于已克隆的稻瘟病菌无毒基因序列和基因组序列,设计了4对特异性引物,对不同来源的31个菌株进行PCR扩增,得到13个指纹类型.同时将31个菌株在7个中国鉴别品种、7个以丽江新团黑谷为背景的近等基因系鉴别品种和12个日本单基因鉴别品种上接种鉴定其致病型,分析菌株指纹类型与致病型之间的关系.结果表明,病菌的指纹类型与基于日本单基因鉴别品种划分的致病型间存在一定程度的对应关系.
关键词:稻瘟病菌;无毒基因;DNA指纹类型;鉴别品种;致病型
中图分类号:Q933;S文献标识码:A文章编号稻瘟病菌致病型的鉴别是以Flor[1]提出的基因对基因学说为基础、通过病菌对一系列鉴别品种的致病性反应来确定的,因此很难从DNA水平上准确把握群体结构的遗传规律.近年来,随着分子生物技术的发展,rep2PCR[225]和基于MGR586探针的指纹分析[628]等为稻瘟病群体结构的研究提供了有力的工具.Levy等[9]的研究结果表明,稻瘟病菌的致病性具有宗谱专一性的特点、国内的研究结果大部分表明遗传宗谱和致病型之间的对应关系不明显稻瘟病菌与寄主水稻之间的关系符合典型的基因对基因模式,因此基于抗病基因与无毒基因的关系对稻瘟病菌分类将更为科学和实用.到目前为止,已克隆并研究得比较详细的无毒基因有Avr2pita[11,pwl124ACE1[15.本研究试图分析稻瘟病菌基于无毒基因序列的指纹类型与基于不同鉴别品种划分的致病型之间是否存在对应关系,以期为进一步研究稻瘟病菌致病型群体结构及变化规律以及水稻抗稻瘟病育种提供依据.
1 材料与方法
1.1 供试菌株选用了中国和日本的菌株(菌系)31个,包括江苏的10个菌株(编号为JS01~JS10),广东的7个菌株(编号为GD01~GD07),浙江的7个菌株(编号为ZJ01~07)及日本的7个鉴别菌系(表1).
1.2 供试品种选用Tetep,珍龙13,四丰43,东农363,关东51,合江18和丽江新团黑谷等7个中国的稻瘟病菌鉴别品种;12个日本的单基因鉴别品种(新2号,爱知旭、藤坂5号,草笛、露明,福锦,K1,Pi4号,砦1号,K60,BL1和K59);中国农业科学院凌忠专先生提供的7个以丽江新团黑谷为背景的近等基因系材料和F214522).
1.3 病原菌培养与DNA提取病原菌的培养和菌丝体DNA的提取按照George等[2]的方法进行.
1.4 引物设计根据GenBank中已登录的4个稻瘟病菌无毒基因和PWL3(U36995)序列,结合引物设计程序,设计不同无毒基因的特异性引物,收稿日期修改稿收到日期
基金项目:国家863计划资助项目(2002AA24131);江苏省自然科学基金资助项目(BK
第一作者简介:王建飞男,博士;鲍永,博士研究生.
901 中国水稻科学~112表1 特异性PCR扩增条带在不同来源菌株中的频率
菌株来源Isolateorigin菌株数No.ofisolates引物对江苏广东浙江日本Japan75444合计Total百分率Percentage%表2 4对特异性引物在31个菌株中的PCR扩增结果
指纹类型菌株来源与编号江苏Jiangsu广东Guangdong浙江Zhejiang日本Japan6-12-15-表示PCR扩增有特异性条带-表示无特异性条带
委托上海申能博彩生物公司合成.引物序列分别为
c23;
aactttgtt23;;
1.5 PCR扩增
25μLPCR反应体系包括:20μLddH2O,2.5μLPCR10×buffer(含Mg2),0.5μLdNTPs(4×10mmolL),引物
0.5μL×2(2.5μmolL),DNA模板0.5μL(18ngμL)和015μLTaq酶(2UμL).PCR反应参数:94℃下预变性4min;94℃下45s,56℃或58℃下45s,72℃下90s,36个循环;最后72℃下延伸10min.PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测.
1.6 数据分析观察并记载PCR产物在琼脂糖凝胶上的电泳结果,将特异性条带的有无分别用和-表示、根据不同引物在同一菌株中的扩增结果,统计出不同指纹类型的菌株(表2).图1 4对特异性引物在部分菌株中的PCR扩增结果
M-DNA分子量标记;泳道1~10-研54220,研53233,研54204,北1,稻72,稻和GD03菌株的扩增条带.
M,DNAmarker;中国水稻科学第20卷第1期(2006年1月)
1.7 稻瘟病菌致病型的鉴定2003年和2004年连续两年春季在南京对31个稻瘟病菌株进行致病型测定.病菌的培养和产孢,接种方法和病情调查按李培富等[16]的方法进行、基于中国鉴别品种的病菌致病型命名按照全国稻瘟病菌生理小种联合试验组所描述的方法[17;基于日本鉴别品种的致病型命名则按照Kiyosawa等描述的方法[18;基于丽江新团黑谷近等基因系鉴别品种的致病型命名则参考日本鉴别体系的方法和潘庆华等[19]的方法.以和L100等代码分别代表该近等基因系的鉴别品种、将感病反应的鉴别品种所对应的代码相加,所得的和之前加上L表示各个菌株的致病型名称.
2 结果与分析
2.1 不同特异性引物的PCR扩增分析Avr2pita引物在17个菌株中扩增得到1.1kb左右(理论长度1189bp)的片段(图12A);Avr12co39引物在18个菌株中扩增得到0.9kb左右(理论长度918bp)的片段(图12B);而PWL2和PWL3引物分别在20个和15个菌株中扩增得到0.5kb左右的片段(图12C,D,理论长度分别为495和436bp).引物Avr2pita在所有菌株中还扩增得到1条250bp左右的非特异性条带.4对引物扩增的特异性条带在广东的菌株中存在明显的地理特征.来自于籼稻区广东的7个菌株中、引物Avr2pita只在GD07菌株中扩增产生特异性条带,远低于平均频率
54.8%(表1,表2);引物PWL3在所有7个广东菌株中均未能扩增出条带,而在31个供试菌株中的平均扩增频率为
4814. 根据特异性条带的有无,用4对特异性引物进行PCR扩增,理论上可以得到16种指纹类型(表和研54204四个菌株能被4对引物同时扩增,划分为指纹类型1(表2);10个菌株被3对引物扩增出特异性片段,划分为指纹类型2,3,4和5;7个菌株能被2对引物扩增产生条带,它们出现在指纹类型和11,没有出现指纹6的菌株;有9个菌株只能被1对引物扩增得到特异性条带,出现指纹类型13和14,没有获得指纹类型12和15;1个广东的菌株(GD04)没有扩增出任何特异性条带.
2.2 稻瘟病菌致病型的鉴定及与指纹类型的关系分析31个菌株经7个中国鉴别品种测定,共检测到5群11种致病型(表3),没有出现A群和D群致病型.其中17个菌株表现为只感丽江新团黑谷的ZG1致病型,占12以上,它们有9种指纹类型.6个菌株为B群的ZB7,ZB13,ZB15和ZB31四种致病型,却出现6种各自不同的指纹类型.4个菌株为E群的ZE1,ZE3两种致病型,出现3种指纹类型.2个属于ZE1致病型的菌株,尽管指纹相同、但该指纹类型中还出现ZB31和ZC11等2种致病型.利用7个丽江新团黑谷近等基因系为鉴别品种、在31个菌株中鉴别出15种致病型(表3).L1致病型只对丽江新团黑谷表现感病反应、共有11个菌株,分布于8种指纹类型
中.指纹类型5有2个菌株均属于L151致病型.指纹类型
10,11和16都只有1个菌株,而且这些菌株所属的致病型中没有出现其他指纹类型.因此致病型与指纹类型间很难确表3 不同来源菌株的致病型与指纹类型的关系菌株编号Isolatecode致病型反应基于菌株在7个中国鉴别品种上的反应命名致病型;B-基于菌株在7个丽江新团黑谷近等基因系上的反应命名致病型;C-基于菌株在12个日本鉴别品种上的反应命名致病型;;
定规律性的对应关系.经12个日本鉴别品种鉴定的致病型与指纹类型存在部分的对应关系(表3).指纹类型1的4个菌株同属于致病型
003.0,指纹类型7和13的各3个菌株分别属于007.0和
000.0,而且这些致病型的菌株没有出现其他的指纹类型,表明两者之间存在对应关系.指纹类型和16都只有1个菌株,这些菌株所属的致病型中没有出现其他指纹类型,它们之间是否存在对应关系需要更多的菌株进行验证.在指纹类型2,3,5,8和14中出现1个以上致病型的菌株,
111王建飞等:基于无毒基因序列的稻瘟病菌指纹类型与致病型的关系初探两者不存在对应关系.
3 讨论目前研究稻瘟病菌群体遗传变异的主要方法有:RAPD[10,MGR5862RFLP[628,rep2PCR[225]和SRAP2PCR[21.
Levy等[9]采用MGR2EcoRⅠ的方法,证明了在遗传宗谱与致病型之间存在简单的对应关系;潘庆华等[19]用SRAP2PCR的方法证明两者之间在一定条件下只存在部分对应的关系.沈瑛等[6]和伍尚忠等[7]用MGR2EcoRⅠ方法并未发现两者之间存在对应关系.其他学者用RAPD和rep2PCR的方法也未能发现这两者之间存在对应关系这些研究采用的都是中性分子标记,并未与致病性相关基因及其功能联系起来.本研究根据已公布的4个无毒基因序列设计特异性引物,对31个稻瘟病菌进行PCR扩增,根据每个菌株特异性条带的有无统计其指纹类型,来研究指纹类型与致病型之间的关系,从而将稻瘟病菌的遗传宗谱与病菌致病型之间直接联系了起来.本研究所用3个不同致病型鉴别体系中、日本单基因鉴别品种确定的致病型与指纹类型存在较好的对应关系,为今后进一步研究奠定了基础.由于本研究只用了31个稻瘟病菌菌株,它们在3个不同致病型鉴别体系中均不能鉴定出所有可能的致病型,4对引物产生的16种理论指纹类型尚缺少3种、一些指纹类型只出现1个菌株,因此需要对更多的菌株进行研究验证.研究只对已经克隆的4个无毒基因设计特异性引物,其指纹类型还不足以覆盖复杂多变的稻瘟病菌群体,而稻瘟病菌显然还有更多未知的无毒基因,因此无法确定那些未知的无毒基因对菌株致病反应的影响、增加了致病型与指纹类型相关性研究的难度.我们还未对扩增条带进行测序验证、所以条带的有无不能直接反映出无毒基因的功能改变与丧失.鉴于以上可能原因和研究中发现的指纹类型与致病型关系这一线索,我们将进一步扩大菌株群体,选择合适的鉴别品种、针对性地测定,比较扩增序列,以更全面,客观,深入地检验这种对应关系.
谢辞:江苏省农业科学院陈志谊研究员提供了江苏省的菌株,浙江省农业科学院孙国昌研究员提供了浙江省和广东省的菌株,中国农业科学院作物科学研究所凌忠专研究员提供了日本的鉴别菌系,特此致谢!
参考文献:
[1] [2] [3] 张重权、何霞红,王云月,等.云南粳稻区水稻品种多样性田间稻瘟病菌群体的遗传结构.中国水稻科学[4] 杨水英,肖崇刚,杨静,等.重庆稻瘟病菌遗传谱系与生理小种的关系研究.西南农业大学学报[5] 雷财林,王久林,蒋琬如,等.我国北方部分稻区稻瘟病菌群体遗传结构研究.植物病理学报[6] 沈瑛、袁筱萍、王艳丽.分子探针在稻瘟病流行病学中的应用研究.西南农业大学学报[7] 伍尚忠,朱小源,杨祁云,等.应用分子标记技术鉴证稻瘟病菌宗谱与寄主遗传背景的亲缘关系.中国农业科学[8] [9]
Phytopathology[10][11][12][13]
[14][15][16]李培富、翟虎渠,张红生,等.两个太湖流域粳稻地方品种抗稻瘟病的遗传研究.中国水稻科学[17]全国稻瘟病菌生理小种联合试验组.我国稻瘟病生理小种研究.植物病理学报[18][19]潘庆华,胡铁柱,王玲,等.稻瘟病菌群体的分子遗传学研究广东地区特异性宗谱菌株的分子指纹和致病型分析.中国农业科学[20]清泽茂久、凌忠专.用日本菌系鉴定中国鉴别品种的稻瘟病
抗性基因.中国科学:B辑211中国水稻科学第20卷第1期(2006年1月)

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