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分子生物学技术在水产养殖中的应用

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≥分子生物学技术在水产养殖中的应用ΤΗΕΑ∏∏∧ΙΧΑΤΙΟΝΟΦΜΟ∧ΕΧΥ∧ΑΡΒΙΟ∧ΟΓΙΧΑ∧ΤΕΧΗ2ΝΙΘΥΕ∑ΙΝΤΗΕΑΘΥΑΧΥ∧ΤΥΡΕ欧阳高亮肖俐李祺福洪水根厦门大学细胞生物学研究室江西医学院细胞生物学教研室分子生物学理论与技术的迅猛发展是近些年来生命科学最为突出的特征目前分子生物学技术在动植物品种改良与鉴定以及人类疾病诊断与治疗等领域中已得到了广泛应用但在水产养殖中应用还很少近些年来许多国家竞相研究和发展与水产养殖有关的分子生物学技术其中竞争的热点在于开发新的优良养殖种类通过生殖和遗传操作培育优良高产抗逆的良种以及寻找检测和防治病害的新技术新方法等因此应用分子生物学技术进行水产养殖品种改良和疾病防治就很有发展潜力本文拟对分子生物学技术在水产育种!种质鉴定!病原体检测以及疾病防治中的应用现状及其应用前景作一综述分子生物学技术在水产育种与种质鉴定中的应用转基因技术随着分子生物学技术的发展转基因生物研究已成为生命科学领域的研究热点之一人们期望通过基因转移技术将外源基因导入某些动植物基因组中以便达到改良或获得某些重要性状如生长快!抗逆性强!生产药用蛋白等的目标其中转基因动物育种研究进展较快应用前景令人瞩目转基因动物技术突破了传统有性杂交的局限性和盲目性克服了物种之间的生殖隔离实现了物种之间遗传物质的交换和重组不仅为遗传物质的研究提供了新的手段也丰富了物种的基因库并为该技术的实际应用奠定了基础自年°等获得转基因小鼠以来目前人们已获得了转基因大鼠!兔!绵羊!猪!山羊!牛!鱼和鸡等转基因动物近些年来转基因育种技术已广泛应用于培育具有优良性状的转基因水产养殖新品种目前利用转基因技术获得的水产养殖动植物主要有转基因鱼!转基因藻另外还有转基因虾!贝等转基因鱼自年朱作言等在世界上首次报道在鱼类中进行转基因研究以来世界上已有许多实验室相继开展了这一领域的工作其中常用于鱼类基因转移的基因为生长激素基因用于转基因的鱼有金鱼!鲤鱼!虹鳟等几十种鱼人们希望用鱼类和哺乳动物的生长激素基因向鱼类转移以期获得有实用价值的个体大!生长迅速的超级鱼0 目前已有不少实验室获得了多种能快速生长的转生长激素基因鱼如∏等年将生长激素基因转移入大西洋鲑获得的转基因个体的重量比对照组平均大倍生长速度比对照组快倍除生长激素基因外抗冻蛋白基因也是鱼类基因转移中常用目的基因之一如于建康等年通过载体成功地将抗冻蛋白基因转入金鱼获得的转化率×等年使用电激法将外源抗寒和生长激素基因导入泥鳅再与卵进行受精从而提高了基因转移的效率另外金属硫蛋白基因!溶菌酶基因!干扰素基因和球蛋白基因等与鱼类抗病抗逆性有关的基因也是目前转基因鱼研究中常选用的靶基因转基因藻藻类是光合自养的低等植物分布非常广泛是海洋生态系和人工养殖生态系的能量和物质基础同时也是海洋药物!功能食品和精细化工产品的重要原料福建省自然科学基金资助项目≤号收稿日期22修回日期22∞∞≥研究综述海洋科学年第卷第期目前组织培养!原生质体融合等传统生物技术已广泛应用于藻类研究但应用分子生物学技术有目的地利用和定向改造藻类生物体系的研究则是近些年才得以开展近几年来从分子水平研究藻类个体发育与系统发育遗传机制的藻类分子遗传学研究发展较为迅速并在此基础上应用重组技术人工构建藻类新品种以及实现藻类天然产物的基因工程生产的藻类基因工程研究也取得重要进展近些年来我国学者围绕构建藻类反应器表达生产蛋白和药物的目标开展了较有特色的藻类基因!载体和表达系统的研究并在转基因海带!鱼腥藻基因工程以及紫菜基因工程等藻类基因工程领域取得较大进展≈目前用于藻类基因工程的目的基因主要有金属硫蛋白基因和超氧化物歧化酶基因等用于基因转移的藻类表达系统主要有蓝藻!螺旋藻!海带!裙带菜!紫菜和江蓠等藻类°技术限制性酶切片段长度多态性°指的是用限制性内切酶切割不同个体基因组后含同源序列的酶切片段在长度上的差异这种差异可以在电泳图谱上筛选并显示出来并按孟德尔遗传定律分离目前°技术已与°≤等技术联用发展已相当成熟在一些经济动植物多基因数量性状的基因定位等方面的研究与应用已取得重要进展但在水产养殖业则刚起步如有人将虹鳟线粒体的°标记用于遗传分析为种质鉴定和遗传育种提供依据随机扩增多态性°技术是在°≤技术基础上发展起来的一项多态性检测技术其基本原理是利用一系列不同的碱基顺序随机排列的寡聚核苷酸单链常为十聚体为引物对所研究的模板基因组进行°≤扩增通过对°≤产物的检测即可对基因组的多态性进行检测°技术可以在对物种没有任何分子生物学研究背景的情况下对其进行多态性分析而且与°! 指纹图谱法等其他多态性检测技术相比°技术具有检测效率高!样品用量少!灵敏度高等特点因此广泛应用于农作物和畜禽品种及品系的鉴定!物种亲缘关系的确定!基因定位和分离以及构建基因图谱等方面的研究目前°技术也已用于水产品群体遗传差异分析如用于高首鲟Αχιπενσερτρανσοντανυσ2减数分裂雌核发育和多倍体的快速鉴定!对草鱼和鲤鱼的群体遗传变异进行研究!对甲壳动物遗传差异进行分析和对银鲫复合种外源遗传物质整入进行°检测≈指纹技术指纹技术是分子生物学新兴技术之一其基本依据是存在于基因组内的高度变异的重复序列微卫星可与众多的基因组酶切片段进行杂交得到具有个体特异性的指纹图谱这种指纹图谱具有高度种属和个体特异性可以用于寻找遗传标记进行遗传连锁分析也可用于测定物种之间的遗传距离以及品种遗传纯度因此可利用该技术测定物种的遗传距离然后选用合适的亲本进行杂交以便提高优势获得产量高!生长迅速的新品种据等年!≤等年! 等年报道目前指纹技术已应用于水产养殖中如用于分析虹鳟的父本和母本对子代生长存活的影响!对雌核生殖罗非鱼和小口黑鲈的不同群体进行鉴别分子生物学技术在水产养殖病原体检测中的应用目前我国水产养殖业尤其是虾类!贝类和鱼类养殖业受到病原微生物的严重影响因此如何快速准确预报和诊断水产动植物疾病就成为当前水产养殖业十分重要而突出的问题进些年来分子生物学技术的迅速发展已经有可能为水产养殖病原体的检测提供快速有效而且特异性强灵敏度高的技术手段≈单克隆抗体技术单克隆抗体技术是和于年发展起来的利用杂交瘤细胞制备大量针对某一抗原决定簇的特异性抗体的技术单克隆抗体与常规血清抗体相比特异性强能识别单一抗原决定簇且容易制备能通过保持细胞系重复获得相同抗体因而在水产养殖病原体检测中得到广泛应用如应用于诊断海湾扇贝Αργοπεχτενιρραδιανσ)的鳃立克次体!诊断与鱼类及牡蛎相结合的淋巴细胞病毒!检测菲律宾蛤仔棕环病病因弧菌°另外近年来已有人利用此技术制备了抗鳗弧菌的单克隆抗体和抗嗜水单胞菌外毒素的单克隆抗体据陈琼等年报道利用该技术制备的单克隆抗体可用于提纯嗜水气单胞菌毒素酶联免疫吸附检测酶联免疫吸附检测∞≥是将抗原或抗体吸附在固相载体表面使抗原抗体反应在固相载体表面进行的一种检测技术该技术将抗原抗体反应的特异性与酶对底物的高效催化作用有机地结合起来通过酶作用于底物后呈现的颜色变化来显示抗原抗体特异反应的存在因此特异性强灵敏度高反应快速结果可以定量也可对抗原!抗体以及抗原抗体复合物进行定位分析目前∞≥法在水产养殖病原体诊断尤其在鱼病学诊断上应用较广国内如钱冬等年用该法检测细菌性败血症病原)))嗜水气单胞菌陈怀青等年应用2∞≥法检测鱼类致病性嗜水气单胞菌毒素黄等年利用单克隆抗体酶联免疫技术检测对虾皮下造血组织坏死病病毒李焕荣等年应用2∞≥法快速检测嗜水气单胞菌的致病因子胞外蛋白酶∞≤°均取得较为满意的效果国外则较早用∞≥法对疖疮病!红嘴病!细菌性肾脏病和爱德华氏菌病等鱼类疾病进行快速诊断另外等≈利用该法鉴定导致菲律宾蛤仔患棕环病的弧菌°核酸杂交技术核酸杂交技术是利用特定标记的或探针和病原体生物中的与探针互补的靶核苷酸序列进行杂交以此来确定宿主是否携带有病原体的一类分子生物学技术可分为≥∏杂交! 杂交和核酸原位杂交该技术以其灵敏度高!特异性强和检验快速等优点近年来在对虾病毒等水产养殖病原体检测中倍受青睐如∏等! 等年将此技术用来诊断细菌性鱼病≤等年应用地高辛标记的探针检测∞病毒在海洋鱼类中的表达∏等年利用地高辛标记的探针检测对虾杆状病毒日本也有人利用地高辛标记的探针进行菌落杂交用于鳗弧菌的鉴定利用经°≤合成的探针与神经坏死病病毒进行杂交选择亲鱼可有效防止病毒性神经坏死症的垂直感染我国的研究人员针对年以来导致我国养殖对虾大规模死亡的病原)))皮下及造血组织坏死杆状病毒已研制出相应的核酸探针用于检测受该病毒感染的对虾°≤技术聚合酶链式反应°≤是体外酶促合成迅速扩增特异片段的一种方法这项分子生物学技术产生虽仅数年却以惊人的速度广泛地应用于分子生物学各个领域目前°≤技术已用于水产养殖病原体检测的实际操作如≤等年利用°≤技术首次成功地进行对虾病毒的扩增等年用°≤方法检测对虾杆状病毒并获得了预计的扩增产物另外也有人应用°≤技术检测贝类肠道病毒以及水或水生生物体内富集的病毒和细菌除应用于病原体检测外°≤技术还与其他分子生物学技术联用广泛应用于水产养殖业其他诸多领域如应用于鱼类生长激素基因!各种分子的克隆应用于检测外源基因是否整合入转基因鱼基因组中应用于制作多基因家族基因组探针以及鱼类种群结构的遗传分析和种质遗传鉴定等细胞培养动物细胞培养技术曾是一门自成体系的现代生物技术近年来随着已建成的数千种动物细胞系株被广泛应用于分子生物学研究细胞培养技术已纳入分子生物学技术体系水产动物细胞培养的研究最早起始于鱼类如等年首次建立了虹鳟生殖腺×2 细胞系同时也以鱼类细胞培养研究开展得较为系统已建立的鱼类细胞系也较多其中我国已建立的部分鱼类细胞系如张念慈等年建立的草鱼吻端组织二倍体≤2 细胞系陈敏容等年建立的鲫鱼异倍体细胞系≤2 左文功等年建立的草鱼肾组织≤细胞系童裳亮等年建立的虹鳟巨噬细胞系与鱼类相比贝类!虾类等水产动物的细胞培养研究国内外报道较少如等年建立了淡水蜗牛胚胎细胞系徐亚立等最近建立了斑节对虾°细胞系目前动物细胞培养技术已应用于水产动物病原体检测如∏等年应用对虾淋巴器官原代培养细胞检测对虾黄头杆状病毒≠另外水产动物细胞培养技术也可用于筛选抗癌药物!培育新品种以及生产疫苗和药物分子生物学技术在水产养殖疾病防治中的应用鱼!虾!贝疾病严重威胁着水产养殖业的发展目前人们用来对付细菌性疾病的主要手段仍然是使用抗生素但细菌适应性很强较易产生抗药性而且抗生素对病毒性疾病无能为力因此除了要加强病原体检测之外更重要的是要培育抗病抗逆性强的水产养殖品种以及开发新的疾病防治技术近些年来的实践表明分子生物学技术在这些应用领域大有潜力可挖如利用重组技术导入抗病抗逆性基因以获得抗病抗逆性强的转基因水产动植物另外也可将基因工程疫苗和反义技术应用于水产养殖疾病防治基因工程疫苗利用基因工程技术可将从细菌或病毒中分离出的具有免疫保护性的抗原基因与载体接合然后将此重组转入大肠杆菌或酵母菌等体外表达系统中从而大量生产作为疫苗用的抗原蛋白质这种基因工程疫苗与常规疫苗相比具有抗原专一!可应用发酵技术进行大量生产等优点目前许多国家已经制备出了基因工程疫苗并在实际中应用在水产养殖方面欧!美!日本等已成功地将弧菌!产气单胞菌!爱德华氏菌等鱼类病原菌制备成全细胞灭活疫苗并且用从菌体中提取的脂多糖!胞外蛋白等有效抗原制备出了单克隆抗体等生物工程疫苗并已商业化生产如等年将从传染性造血组织坏死病毒中分离到的糖蛋白基因的≥∏片段转入埃氏大肠杆菌中得到一种具有较强免疫原性的糖蛋白抗原该基因工程疫苗能有效防治传染性败血症的感染反义技术反义技术是近十多年来发展起来的反义核酸技术和核酶技术的总称可以用来特异性地阻断病毒功能的发挥反义核酸技术可分为反义技术和反义技术但一般常指反义技术反义是以有义链为模板合成的及其衍生物它可通过与相应的互补结合而阻断其功能目前使用人工合成的反义已在原核细胞和真核细胞中成功地抑制了多种病毒基因的表达核酶则是一种具有催化作用的它通过碱基配对与靶相互识别!结合并催化水解靶因此它既有反义的作用又能以序列特异性地切割靶现已有不少研究显示核酶可用于对病毒靶进行切割不过目前还未见到有关成功应用反义技术来治疗水产养殖动植物病毒性疾病的报道但作为一种特异性较强的治疗技术反义技术还是很有应用开发潜力的结语目前分子生物学发展非常迅速应用也非常广泛但从总体上来说不管是国内还是国外将分子生物学技术应用于水产养殖业目前还很不广泛尚处于起步阶段虽然如此近些年来国际上许多国家竞相利用分子生物学技术来改造传统的水产养殖业我国作为一个水产养殖大国水产养殖业发展较快但也面临育种!病害防治等诸多挑战因此将分子生物学技术以及其他现代生物技术应用于水产养殖优良品种培育!种质鉴定!病原体检测以及疾病防治等领域就很有发展潜力和经济价值并且将对水产养殖业的发展产生重大而深远的影响主要参考文献秦松等海洋与湖沼27秦松等生物工程进展16章怀云等水生生物学报22项超美等水生生物学报22周莉等水生生物学报22洪水根福建水产∞εταλ. . Αθυαχυλτυρε×εταλ. . Αθυαχυλτυρε,本文编辑刘珊珊

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