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珠海校区生物学科实验室开放式实验教学

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珠海校区生物学科实验室开放式实验教学
实验题目:人类性别的DNA技术鉴定
主要内容:扩增X,Y染色体片段进行PCR性别鉴定,是广泛应用于法医学的DNA技术.包括了核酸的分离和提取,聚合酶链反应等分子生物学的实验内容.实验涉及离心、电泳, PCR,紫外成像等现代生物学常用技术方法.
实验目的:通过实验、可提高学生对现代生命科学的认识,培养学生的实验技能.为提高学生的综合素质和培养创新能力奠定基础.
实验时间:2001学年度起,报名参加实验的学生利用课余时间,分期分批地进行.
教学对象:生命科学学院的生物科学,生物技术和药学三个专业学生以及部分理科其他专业的学生.
指导教师:程蕾何容飞吴玉萍龙天澄
实验要求:
1,学生在报名参加开放实验前、需认真安排好自己的学习时间.报名参加实验后,按照老师的安排进行学习和做实验.无特殊原因,不能中途退出.更不能想来就来,想走就走.
2,参加开放实验的学生要严格遵守实验教学纪律,严格遵守实验室规章制度,严格按规程操作实验仪器.
3,实验操作中要小心谨慎,爱护仪器设备,防止意外事故.
4,实验项目结束后,需交一份附有实验结果的实验报告.
报名方式:各专业学生若能做到上述要求,则本着自愿原则,在实验中心或指导教师处报名、购买《实验指南》.报名者人数较多的情况下,将进行双向选择,优培生,学习成绩优秀的学生优先.
第一章DNA的分子特性与利用,脱氧核糖核酸生物界中、每一个细胞(成熟的红细胞除外)都含有脱氧核糖核酸(DNA),甚至有些病毒虽然没有细胞结构,也含有DNA.DNA携带着决定生物遗传,细胞分裂,分化,生长以及蛋白质生物合成等生命过程的控制信息.DNA不仅能控制和维持生命过程中各种机能的运行、使每个物种一代一代传下去,而且DNA在生物体为适应环境或遭受刺激时会稍稍改变其结构,使物种适应新环境而生存.由于DNA分子结构的改变以及种类的增多,在生物进化过程中起了不可磨灭的作用.现在基因工程已能在DNA分子中引进特殊的DNA片段,能使生物物种改良,或使某些生物体制造人类所需的蛋白质及肽类,或者使人类的遗传性疾病得到治疗.
DNA主要是由脱氧腺嘌呤核苷酸(A),脱氧鸟嘌呤核苷酸(G),脱氧胞嘧啶核苷酸(C)以及脱氧胸腺嘧啶核苷酸(T)所组成的双螺旋结构.
碱基配对是DNA分子结构的重要特性,这意味着两条链的碱基序列是互补的.也就是说,一条链中的腺嘌呤(A)总是与另一条链中的胸腺嘧啶(T)配对、一条链中的鸟嘌呤(G)总是与另一链中的胞嘧啶(C)配对.例如一条链的碱基顺序是AATGCT,另一条链按同一方向阅读的顺序就是TTACGA.DNA双股螺旋的两条多核苷酸链是反向平行的,即一条链的3-OH端与另一条链的5磷酸端相邻.
二、DNA变性当温度升高时,蛋白质和核酸的三维结构都会受到破坏,受破坏的大分子称为变性分子,此时分子呈近乎无规则线团样的构象.从天然状态分子转变为变性状态分子的过程称作变性.将双链DNA或天然DNA加热时,两条链之间的结合力受到破坏,两条链分离,因此,变性的DNA是单链的.
高pH是一种有用的变性方法,因为它可使一些参与形成氢键的基团所带的电荷发生改变,而携带电荷的这些基团的碱基也就因此失去了形成氢键的能力.在pH大于11.3时,所有的氢链断裂,DNA完全变性.因为DNA对碱水解很稳定,所以这是基因工程中对DNA变性常选用的一种方法,就像加热使磷酸二酯键断裂一样.
虽然DNA是稳定的,但这是种动态结构,它的双链区经常被打开变成单链的泡状.双链DNA部分链区被打开的现象称为呼吸(breathing).呼吸现象可能是使特定的蛋白质能与DNA分子发生相互作用和阅读它的编码的信息.由于GC碱基对有三对氢键,AT碱基对仅有两对氢键,所以在DNA分子的富含AT对的区域比富含GC对的区域更容易发生呼吸.
三、复性与杂交变性DNA溶液经处理后可重新形成天然DNA,这个过程称为复性(renaturation)或退火(reannealing).重新形成的DNA称为复性DNA.复性是基因工程中很有意义的特性.这可以用于显示不同生物体间的遗传相关性,检测特定的DNA,考察某些序列在特定生物体DNA中是否出现一次以上,确定特定碱基序列在DNA中的位置,等等.
发生复性必须有两个条件:①盐浓度必须高到足以消除两条链中的磷酸基团的静电斥力、通常用molL NaCl.②温度必须高到足以破坏其随机的链内氢键,但温度不能太高,否则不能形成和维持稳定的链间碱基配对.
每个复性的天然DNA分子不是由它自己原来的两条单链形成的,即复性是随机结合的过程.当复性DNA分子由不同的两单链分子形成时,复性称为杂交
硝基纤维素滤膜与单链DNA结合得非常牢固、但它不会与双链DNA或RNA结合,这为测定杂交提供了重要的技术.滤膜杂交最重要的用途是检测DNA单链和RNA分子间的序列同源性,这可称为DNARNA杂交.这是检测从特定DNA分子上拷贝下来的RNA分子的选择方法.这个方法中、将结合着单链DNA的滤膜放入含有放射性的RNA溶液中、复性后洗涤滤膜,根据滤膜上存在的放射性RNA来检测杂交.
复性的初始事件是分子碰撞,因此复性速度服从质量作用定律,随着DNA浓度增加而增加.利用这种浓度相关性发现了真核生物和原核生物中DNA的某些意想不到的特性.
例如两种具有相等浓度的DNA溶液,用g ml(不是摩尔浓度)表示、假定每种溶液中分子的分子量不同、较小的分子复性较快、因为它们的摩尔浓度较高,并且单位时间中碰撞机会多.这一点是复性动力学的原理.将此原理用于片段化的一组相同DNA分子,可获得分子内重复碱基的序列的信息.
四、DNA的复制细胞分裂的遗传物质准确地进行复制并代代相传.这是因为DNA双链打开后,每一条单链都可以作为模板,合成两条结构完全相同的双股DNA链.DNA不仅能准确复制,而且复制速度很快.DNA复制时,脱氧核苷酸进行聚合作用,A跟T配对、C跟G配对.细菌细胞每秒钟约有500个dNTP发生作用,哺乳动物细胞每秒钟约有50个dNTP发生作用.复制的准确性及快速是由于复制过程的进行有其特定的方式,有多种酶及复制因子参与反应.
复制起始点(origin,ori),原核生物的复制起始点常位于染色体中的特定的部位、即只有一个起始点.真核生物是在几个特定部位上进行复制,所以有几个起始点.酵母的基因组与所有的真核基因组相同、具有多个复制起点.
DNA的复制过程十分复杂.首先是在多种酶及蛋白质因子参与下DNA超螺旋的松弛及双螺旋的解链.解链酶在复制叉的行进过程中连续地解开DNA的双链.一般而言、解链酶是与后随链(1agging strand)的合成模板结合,并沿着模板的5→3方向随着复制叉而移动.复制过程中前导链的复制是连续的,但后随链的复制是不连续的,首先需合成一段RNA引物,进入引发过程,然后再进入DNA链的合成.引发过程也是在复制的起始点ori进行的.DNA链的延长是在DNA聚合酶的作用下,以四种三磷酸脱氧核苷(dNTP)进行聚合作用.
五、DNA的修复DNA分子的完整性对于细胞是非常重要的.在几亿年的进化过程中、DNA复制时可能由DNA聚合酶引发偶然的错误.环境因素(如辐射,紫外线照射,致突变的化学物质等)都可能引起DNA产生序列上的错误.如果这些错误全部保留下来而未被改正,则在生长的及不生长的体细胞中会积累下许多DNA的损伤,从而影响生物的某些功能.性细胞的DNA发生了突变会影响到后代.但是,生物体内存在着有效的修复体系,才保证了DNA复制的高度精确性.DNA修复体系在各种类型的细胞中都是很重要的.但是DNA的损伤或突变也不可能全部被修复、否则就不存在变异.生物体如果具有绝对完全的DNA修复能力、生物就不能进化了.
六、生物的基因重组基因是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位.对于编码蛋白质的结构基因来说,基因是决定一条多肽链的DNA片段.
生物在进行繁殖时,要把它的遗传信息精确地传递给后代.在代代相传中、DNA的变化是很小的.在一个相对短的时期内、遗传的稳定性对于维持生物的生存是很重要的.但是在一个较长的期间内、生物体的生存则要取决于遗传的变化,以适应环境的变化.遗传的变化来自DNA的重新排列,即基因的重组通过对简单的生物体如细菌和病毒的研究,人们对于基因重组的生化途径有了一些认识.基因重组可以分为两类:一般重组及定位重组.一般重组是指遗传信息在同源的DNA序列之间发生交换而重排.定位重组不是发生在同源染色体之间,而是在两个特定的DNA序列之间.例如噬菌体,DNA整合到大肠杆菌染色体DNA中、沙门氏菌的一对鞭毛基因通过DNA片段的倒转排列调节其交替表达等等.这也说明了基因重组在基因表达的调控中有重要作用.真核生物也不例外,例如抗体生成的调节中也有定位基因重组作用.重组还特别地发生在或卵细胞形成过程中.
基因重组有重要的生物学意义.一般基因重组在DNA修复中起关键作用.基因的重排可以产生新的基因,这是生物进化的原因.基因重排在基因表达调控中也有重要作用.一个基因是处于静止状态还是活化状态取决于它在染色体上的位置与方向.
既然生物体的DNA变异能够产生新的生物性状甚至形成新的物种、那么人们也可以人为地改变生物的遗传特性,从而获得符合人类要求的生物新特性和生物新个体.这个愿望促使人类利用生物遗传原理,从最基本的DNA提取开始,到基因的剪切,连接和组合,进行了艰苦而漫长的改造自然,改造生物的伟大实践,这就是基因工程.
七、DNA的分离和提取生物体内的核酸、尤其是DNA,总是与蛋白质结合在一起,要提取DNA首先要去除其所结合的蛋白质,然后使用一些现代技术和方法,将DNA与RNA分开、再纯化DNA.
溶解法:将破碎后的细胞在苯酚与或氯仿异丙醇混合液中轻轻摇荡,以沉淀蛋白质及其他杂质,然后离心以去除之.还可以选用去污剂,氯化胍(guanidinium chloride),高浓度氯化钠溶液或链霉蛋白酶(pronase)水解作用,以去除蛋白质.无论用哪种方法得到的都是DNA与RNA的,可以用乙醇将其沉淀出来,然后用RNase将RNA水解掉、即可获得较纯的大分子DNA.此外,也可以用超速离心方法将RNA与DNA分开.必须指出、在所有操作过程中、都必须注意防止DNase的存在,以避免DNA被降解,所以应该带上塑料手套,注意用EDTA消除操作工具上的对DNase有利的二价金属离子,以及用高温处理所有玻璃器皿.
层析法:层析法有很多种、一般都可用于分离核酸、如纸层析及薄层层析法等.但这些方法已被高压液相层析(high-pressure liquid 和反相层析(reverse-phase 所取代.DNA分子很大,在分离时,也经常用离子交换层析及凝胶过滤层析.
羟磷灰在层析法中、对分离和纯化特别有用.双股DNA与羟磷灰石的结合比绝大多数其他分子的结合更为牢固.如将细胞的溶解液流经羟磷灰石柱,然后用低浓度磷酸缓冲液冲洗,以除去RNA,蛋白质及其他物质,随即再用浓度高的磷酸缓冲液洗脱,即能获得DNA.
单股DNA可以用浓度低于双股DNA所需的磷酸缓冲液从羟磷灰石柱上洗脱下来(图3.3).不同核苷酸组成的DNA在羟磷灰石柱上,可用热层析(thermal 将其分开.不同的双股DNA与柱中羟磷灰石结合后,在洗脱时逐渐加高温度,当一种DNA达到其熔解温度(Tm)时,即会分解成单股而被洗脱下来.不同的核苷酸组成的双股DNA有不同的Tm,因此在热层析法中、Tm低者将先被洗脱下来,Tm高者必然是被后洗脱出来.双股DNA的Tm与其所含的GC碱基对的多少有关,GC对多者其Tm就高.这样看来,羟磷灰石的热层析法是分离不同碱基对组成的DNA的一种简便方法.
电泳法:某些小分子核酸可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳 gel 将其分开.其电泳迁移速度与分子大小有关,分子大者迁移慢,分子小者快.但是由数千碱基对组成的DNA就不能进入聚丙烯酰胺凝胶,这个困难可以用适当低浓度的琼脂糖凝胶部分得到解决,使用这种方法能将细菌及酵母中的质粒与较大的染色体DNA分离开来.
DNA的常规凝胶电泳,即使是只含0.1%琼脂糖的凝胶中、也只能分离由100 000碱基对以下的DNA.Canton与Smith建立的脉冲电场凝胶电泳(PFG)可以将1 000万以上碱基对组成的DNA分离开来.脉冲电场凝胶电泳装置是在琼脂糖胶板外面安置两对或更多电极.不同电极对连续不断产生脉冲,其时间长短不同、可以从0.1到1 000秒,这需按被分离DNA分子大小而定.电泳使那些伸直的DNA分子在凝胶中错综复杂的通道内缓慢:迁移,从负极向正极前进.一旦电场的方向改变了,DNA必须重新调整其长轴,然后才能顺着新方向迁移前进.调整长轴过程需要的时间是以DNA分子的大小而定.DNA分子大者长度长所需调整时间就多,DNA分子小者就短、所需调整时间就少.必须指出、使用这种电泳时,电场方向往往需要改变多次.如果所选定电极分布恰当以及脉冲长短适应、能使DNA分子短者迁移快、分子长者慢,这样就能将不同DNA分子很好地分开.
凝脉电泳虽然可以将不同的DNA分开、但经过电泳后的凝胶必须用有机染料染色,才能使分开的DNA区带显示出来,以便于辨认和提取.双股DNA可用某些特殊的芳香族阴离子染料,如乙锭(ethidium)离子,吖啶橙(acridine orange)或3,6二氨基吖啶(proflavine).这些染料将嵌入双股DNA的碱基对堆叠之间.这样,染料在紫外线下显出的荧光远比单独存在时要强得多.凝胶中DNA的量即使少到50ng,溴化乙锭亦能将其显露出来.单股DNA及RNA也能激发溴化乙锭的荧光、但没有双股DNA那样强.
不同DNA可用凝胶电泳将其分开、也可用限制性酶按需要切割成片段,但是如果要获得所需要的特定序列DNA片段,还需要应用一些其他手段,如各种印迹技术等.
超速离心法:核酸分子巨大,尤其是DNA分子,其密度不同、所以根据其密度常用平衡密度梯度超速离心法将其分离开.基因工程操作中常要提取质粒DNA,在抽提质粒DNA的过程中、容易被线状染色体DNA污染,尤其是分子量与质粒DNA相近的染色体.而氯化铯(CsCl)密度梯度超速离心法抽提质粒DNA具有纯度高,步骤少,方法稳定,且获得的质粒DNA多数和为超螺旋构型等特点.目前已成为国际上各实验室普遍采用的方法.
溴化乙锭(EB)是一种吖啶类染料,它可以插入DNA的碱基对之间,使DNA的体积增大,浮力密度变小.EB容易插入线状的DNA,而与环状质粒DNA的结合量小于与线状染色体DNA的结合量,从而使两者的浮力密度出现悬殊的差别、更利于离心时分离.
CsCl是一种高分子量的重金属盐.在高速离心条件下,就会在离心管中形成CsCl密度梯度.将DNA样品加EB与CsCl一起离心、当DNA的沉降速度与扩散速度达到平衡状态时,DNA就形成一稳定的区带.在合适的CsCl密度梯度范围中、DNA就处在一定的位置上,这时DNA的浮力密度就等于该位置上的CsCl的密度.由于质粒DNA的浮力密度大于线状染色体DNA的浮力密度,染色体DNA的区带在上层,质粒DNA的区带在下层.两者能明显地分开而达到分离的目的.
在提取的样品中、还含有大量RNA.一般来说,DNA与RNA的浮力密度是与CsCl,H20相互作用有关,而RNA在CsCl中总是与Cs相结合,故密度很大.在超速离心时, RNA将沉入离心管底,这样就可以与质粒DNA相分离.
EB是强致癌物质,必须戴手套谨慎操作.EB在可见光条件下会自身分解,从而引起DNA分子的断裂.因此当样品加入EB后,注意避光.超速离心后的离心管中DNA分离成不同高度的密度条带,能在紫外线(特别是波长260nm)下显露出来,把毛细吸管精确定位插入离心管对不同条带吸取.
分离真核细胞的主体DNA及卫星DNA(satellite DNA)如线粒体中及叶绿体中的DNA,以及重复序列串联成片段DNA等、都是用这种离心分离法.
第二章各种工具酶
一、工具酶与基因工程基因工程的操作,是分子水平上的操作,它是依赖一些重要的酶(如限制性内切核酸酶,连接酶,聚合酶等等)作为工具来对基因进行人工切割和拼接等操作,所以把这些酶称为工具酶.
自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类.这些酶类参与微生物的核酸代谢,在核酸复制和修复等反应中具有重要作用,有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA,进而降解非己DNA的防御工具.在研究掌握了利用这些酶类对基因切割,拼接操作方法后,人类获得了最好的基因工程工具,扩大了人类改造生物的能力、现在许多厂商生产分子克隆产品、因而保证了这些酶制剂的广泛供应.随着越来越多的酶分子被发现,工具酶的数量和用途有所增加.这些进展不仅简化了分子克隆的操作,而且拓宽了研究领域.
噬菌体在某一株细菌的生长能力在其移到另一株细菌宿主时,要受到一定限制,而将此噬菌体移回到原来的那株细菌宿主繁殖,再次移回到第二株宿主时,生长能力受到进一步限制,这种现象称为宿主控制限制 restriction).在宿主细胞中、噬菌体生长的限制伴有噬菌体DNA的迅速降解,这是DNA受到限制性酶的作用.
用作繁殖噬菌体的感染宿主株并不会产生DNA降解,这是因为它具有宿主控制性修饰 modification)作用.这个修饰包括对限制性酶的识别、对DNA序列内某些碱基甲基化.甲基化能保护识别序列免遭限制酶的作用.
细菌中的限制性酶的生物学作用还不明白,一般认为限制性酶构成了细菌抵抗有害DNA的防御机能,提供细菌种属和菌株之间进行交叉繁殖的屏障,但允许异源DNA有某些通过,这可能有利于进化.有人认为限制性酶实际上是演变而成的某种重组体系,能提供极为有限的甚至可能是很特殊的重组机会.某些重组可能是合乎需要的,但是这种情况的重组又受到有关酶的靶序列大小的制约,并进而因为修饰反应而受到约束.
能将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶,称为核酸酶.核酸酶中倾向于将核酸内部的二酯键切断的核酸酶,称为内切核酸酶.而核酸酶中从多核苷酸链一端切割核苷酸的核酸酶,称为外切核酸酶.内切核酸酶中能够识别DNA分子上某一特定的碱基序列并且将其切开的那一类,特称为限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)一般叫限制酶.
二、限制酶限制酶的发现给基因工程的发展起了巨大的推动作用.限制酶是基因工程中不可缺少的工具酶,有人把它比喻为基因工程的手术刀.限制酶切点专一、它作用于DNA分子,产生特异的DNA片段.用DNA连接酶,可将这种DNA片段与用同种限制酶处理得到的另一种DNA片段连接起来,而组成杂合DNA分子.
几乎所有种类的原核生物都能产生限制酶.根据结构和功能特性,可将限制酶分为Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ型. I型和Ⅲ型限制酶的切点不固定,不能产生可以利用的DNA片段,只有Ⅱ型限制酶具有可以控制和预测的位点特异性切割的性质, 并且产生固定的DNA片段,因此基因工程中所用的限制酶都是Ⅱ型限制酶.
Ⅱ型限制酶是一种位点特异性酶,能够识别双链DNA分子中的特异序列,并在特定部位上水解双链DNA中每一条链上的磷酸二酯键,从而造成双链缺口,切断DNA分子.限制酶的识别序列一般为48个核苷酸、这些序列大多呈回文结构,也就是说,序列正读和反读是一样的.由于大多数Ⅱ型限制酶在双链核苷酸回文序列中相应的部位上进行切割,因此,经限制酶切割的双链DNA形成所谓的粘性末端,也就是DNA末端由几个碱基组成的能与具有互补末端的DNA片段连接的部分,多数限制酶在作用后产生具有5末端突出或3突出的粘性末端.例如EcoRⅠ和BamHⅠ在切割双链DNA形成3粘性末端,PstⅠ切割双链DNA形成5粘性末端.
与其他酶学反应一样,应用各种限制性内切酶切割DNA时需要适宜的反应条件,包括温度,pH值和离子强度等等.限制酶的活性单位是指某种限制酶在最适反应条件下,1微克DNA于1小时完全酶切的酶量.在DNA重组技术中、限制酶主要用于:1)在特异位点上切割DNA,产生特异的限制酶片段;2)建立DNA分子的限制酶图谱;3)构建基因文库;4)用限制酶切出的相同的粘性末端,以便重组.
三、DNA聚合酶DNA聚合酶的种类很多,它们在细胞中DNA复制过程中起着重要的作用.DNA聚合酶有DNA聚合酶Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ三类.基因工程中很多步骤都需要DNA聚合酶催化DNA体外合成反应、这些酶作用时大多都需要模板,合成产物的序列与模板互补.基因工程常用的DNA聚合酶有:①大肠杆菌聚合酶I (全酶);②大肠杆菌聚合酶I大片段(Klenow片段);③T4噬菌体DNA聚合酶;④T7噬菌体聚合酶及经修饰的T7噬菌体聚合酶(测序酶),⑤耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶);⑥末端转移酶(末端脱氧核苷酸转移酶,也属DNA聚合酶);⑦逆转录酶(依赖于RNA的DNA聚合酶).
DNA聚合酶I是基因工程中最常用的工具酶.DNA聚合酶Ⅱ是一条120kD的肽链,催化5→3方向合成DNA,也具有3→5外切酶活性但没有5→3外切酶活性.可能在当细胞DNA受到化学或物理损伤时,DNA聚合酶Ⅱ在修复过程中起特殊作用.DNA聚合酶Ⅲ全酶是一种大于250kD,由多种亚基组成的蛋白质,它是不对称的二聚体,两个亚基可分别同时催化前导链(1eading strand)及后随链的合成. DNA聚合酶Ⅲ与DNA聚合酶Ⅰ相同、也具有3→5外切酶活性.在DNA聚合作用中、核苷酸添加的错误率达由于DNA聚合酶Ⅰ和DNA聚合酶Ⅲ全酶的3→5外切酶活性,可以终止核苷酸加入并除去错误核苷酸、然后可继续加入正确的核苷酸、可将错误率减少到百万分之一或更少.
耐热DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶):这是一种耐热的依赖DNA的DNA聚合酶(分子量65kD),原是从嗜热的水生菌Thermus aquaticus中纯化来的,现在以基因工程生产并出售(AmpliTaqTM).这些酶具有依赖于聚合物5→3外切核酸酶活性.用途:①用于DNA测序,②用于聚合酶链式反应(PCR)对DNA片段进行体外扩增.
四、DNA连接酶能将两段DNA拼接起来的酶叫DNA连接酶.该酶催化DNA相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键,使DNA单链缺口封合起来.大肠杆菌和动植物细胞中都有DNA连接酶.为将限制性酶切片段共价地连接起来,可使用T4 DNA连接酶,或大肠杆菌连接酶.T4 DNA连接酶是分子量68kD的多肽,是T4噬菌体感染大肠杆菌而产生的.在连接反应中以ATP为辅助因子,是应用最广的连接酶,有商品供应.它的用途有:①连接带匹配粘端的DNA分子,②使平端的双链DNA分子互相连接或合成的接头相连接.大肠杆菌DNA连接酶能使互相匹配的5突出端和3突出端的双链DNA连接,反应中以NAD作为辅助因子,基因工程中不常用.
第三章目的基因的制取
一、目的基因基因工程主要是通过人工的方法,分离,改造,扩增并表达生物的特定基因,从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物.通常我们把插入到载体内的那个特定的片段基因称为外源基因,而将那些已被或者准备要被分离,改造,扩增或表达的特定基因或DNA片段,称为目的基因.
DNA是十分庞大的生物分子.病毒含有几千到几十万个核苷酸.原核生物的DNA分子平均约有106个碱基对、真核生物的DNA分子可达109个碱基对、以每个基因平均1 000个碱基对进行粗略计算,大肠杆菌约有个基因,人细胞的基因可达200万个.虽然其中某些基因,特别是真核细胞的一些基因是多拷贝的,在基因组内有多个甚至极多个重复、实际上基因数要比上述推算的基因数可能要少得多.尽管如此,原核细胞和真核细胞,特别是真核细胞的基因组内基因数目仍是极其巨大的.如此巨大的基因组不可能直接全部重组.
要从数以万计的核苷酸序列中挑选出非常小的所感兴趣的目的基因,是基因工程中的第一个难题.基因工程中常用的目的基因,如乙型肝炎病毒表面抗原基因,生长激素基因,干扰素基因等等、都仅有几千个或几百个甚至更少的碱基对的DNA片段.人生长激素释放抑制因子的基因只有42个碱基对.
欲想获得某个目的基因,必须对其有所了解,然后根据目的基因的性质制定分离基因的方案.有时人们对某一目的基因的性质,结构尚无所知,而获得这一基因,分析该基因的结构与机能的关系,揭示基因表达的调控规律,是分子生物学研究的任务之一.
所谓目的DNA的性质主要指所希望分离或克隆的基因是来自于染色体组还是来自eDNA,如果来自真核生物的染色体组,可称为染色体基因组拷贝(genomic copy);如果来自cDNA,可称为cDNA拷贝(cDNA copy).一个基因的cDNA拷贝是利用逆转录酶,将经过加工的mRNA,逆转录而成.这种cDNA拷贝缺少位于5非转录区域的调节信号以及内含子.内含子(不翻译的间隔序列)是大多数真核基因特有的性状,在蛋白质翻译前、从mRNA前体上去除了,因此一个基因的染色体基因组拷贝包含着基因的调控区域,内含子及外显子等.就DNA长度而言、cDNA拷贝(2kb一3kb)显然比染色体基因组拷贝要短.如果要克隆真核生物染色体基因组中的某个目的基因(即染色体基因组拷贝)、一般采用的策略是构建完整的文库,从文库中筛选出目的基因.
随着生物化学,分子遗传学和分子生物学技术的发展,包括基因工程技术本身的进步,如今已有很多基因被分离出来. 目前主要应用化学合成法,物理化学法(如密度梯度离心法,单链酶法,分子杂交法),鸟枪无性繁殖法,酶促合成(逆转录)法等.
二、鸟枪法这是一种由生物基因组提取目的基因的方法.首先利用物理方法(如剪切力、超声波等)或酶化学方法(如限制性内切核酸酶)将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段,继而将这些片段与适当的载体结合,将重组DNA转入受体菌扩增,获得无性繁殖的基因文库,再结合筛选方法,从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株,从中将重组的DNA分离,回收.这种方法也就是应用基因工程技术分离目的基因,其特点是绕过直接分离基因的难关,在基因组DNA文库中筛选出目的基因.可以说这是利用溜散弹射击原理去命中某个基因.由于目的基因在整个基因组中太少太小,在相当程度上还得靠碰运气、所以人们称这个方法为鸟枪法或散弹枪实验法.
真核生物基因大都由有编码功能的序列即外显子和无编码功能的序列即内含子两者比例为1:4构成.鸟枪克隆法在基因组DNA文库中筛选到的目的基田,与染色体中的天然基因是一样的,含有内含子,在结构基因两端的连接区还有转录调控序列片段,即调节基因.这样的基因可供基因表达的调控分析.因为有内含子的存在,这样获得的结构基因不宜在原核宿主组织中表达.
例如,面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的制取,先用EcoR I把面包酵母DNA切成许多片段,使这些片段与入载体连成重组DNA,再把这些重组DNA导入吲哚甘油磷酶脱氢酶型组氨酸缺陷型大肠杆菌、在基本培养基中培养.只有引入了该基因的细菌才能生长,这样就使这种菌株分离,得到目的基因.
三、物理化学法
1.物理化学法分离基因的基本原理从几个方面来利用核酸DNA双螺旋之间存在着碱基G和C配对、A和T配对的这一特性,以达到从生物基因组分离目的基因的目的.
2.物理化学法分离基因的主要方法
物理化学法分离基因目前主要有:①密度梯度离心法,②单链酶法,⑧分子杂交法.
密度梯度离心法:液体在离心时,其密度随转轴距离而增加.碱基GC配对的双链DNA片段密度较大,利用精密的密度梯度超离心技术可使切割适当片段的不同DNA按密度大小分布开来.进而通过与某种放射性标记的mRNA杂交来检验、分离相应的基因.非洲爪蟾rDNA,5s DNA和海胆组蛋白基因就是这样分离得到的.
单链酶法:碱基GC配对之间有三个氢键,比AT配对的稳定性高.当用加热或其他变性试剂处理DNA时,双链上AT配对较多的部位先变成单链,应用单链特异的S1核酸酶切除单链,再经氯化铯超速离心、获得无单链切口的DNA.海胆rDNA就是这样首先分离得到的.
分子杂交法:单链DNA与其互补的序列总有配对成双的倾向,这就是分子杂交的原理.利用分子杂交的基本原理(如DNA:DNA配对或者DNA:RNA配对)既可以分离,又可以鉴别某一基因.例如果蝇的18S,28S rDNA就是这样首次被分离得到的.
四、化学合成基因如果已知某种基因的核苷酸序列,或者根据某种基因产物的氨基酸序列,仔细选择密码子,可以推导出该多肽编码基因的核苷酸序列,就可以将核苷酸或寡核苷酸片段,一个一个地或一片段一片段地缩合起来,成为一个一个基因的核苷酸片段(图5.1).
为了保证定向合成,需要将一个分子的5端与另一个分子的3端封闭保护.这种封闭可用磷酸化等方法,必要时可以酸或碱解除封闭.
原先人们只能利用化学合成法合成比较短的DNA片段,如今已成功合成酵母丙氨酸tRNA基因,人生长激素释放抑制因子,胰岛素原,脑啡肽和干扰素等基因.
可以先合成许多分别属于双链序列的8~12碱基对(basepair,简写bp)的片段,这些片段由对应碱基来看是交错排列的,即当两个片段的对应部分配对后,两端还留有单链的末端.第三个片段可以通过和这种末端配对而排列在适当的位置.如果这些片段5羟基已经过磷酸化反应、DNA连接酶即可将同一链上的相邻片段连接起来.对分子量较大的基因,可分几步进行合成,通常是先合成几个有单链末端的双链片段,再经过同样方式连接成为完整的基因.基因的化学合成法自从DNA合成仪问世以后,已不存在太难的技术问题.但是因单核苷酸原料多半需进口,价格昂贵.
五、酶促逆转录合成法酶促逆转录合成法即利用逆转录酶由mRNA逆转录合成的方法.主要用于合成分子量较大而又不知其序列的基因.这种方法是以目的基因的mRNA为模板,借助逆转录酶合成互补的DNA,即cDNA,再在DNA聚合酶的催化下合成双链eDNA片段,与适当的载体结合后转入受体菌、扩增为eDNA文库.然后,采用适当的方法从eDNA文库中筛选出目的基因.例如家兔和人的珠蛋白基因,电鱼和牛等乙酰胆碱受体四种亚基基因及当前发现的大多数哺乳动物基因,多是这种方法分离成功的.关于单链和双链cDNA酶促合成,如图5.2所示.
六、聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)也可以当作一项极其重要的酶促合成DNA技术.PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法,是基因扩增技术的一次重大革新,它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍.70年代初、Kleppe等人就提出了PCR的工作原理,由于当时的基因工程还处于摇篮时期,这项工作遭受到冷遇.Saiki(1985)和Mullis(1986)两家研究室分别用改进的Kleppe法获得了大量染色体DNA单拷贝基因.当时的PCR技术须在每次变性和退火后,扩增反应前重新加入DNA聚合酶.1988年,由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶,这是从水生栖热菌(Thermus aquaticus)中提取的耐热DNA聚合酶,简称TaqDNA聚合酶.多次循环后的TaqDNA聚合酶仍然具有活性,因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶促合成,使反应产物按指数增长,所以命名为聚合酶链式反应.
RCR操作体系中含有双链模板DNA(这是我们所感兴趣的基因片段即目的基因),热稳定的DNA聚合酶和一对引物.在设计引物时(现在一般用电子计算机设计),需考虑使这两条引物分别与模板DNA两条链的5,端特定序列互补,并恰好使选择的互补序列分别位于待合成的DNA片段的两侧.此外,反应体系还应该供给合成时所需要的原料-三磷酸脱氧核苷.在适当的缓冲体系中加上上述物质后,置于特殊的装置自动温度循环器,加热至高温(一般为94℃、90秒钟),将所需要扩增的靶DNA单链热变性处理,解开为两个寡聚核苷酸单链.这个过程中加入一对根据已知DNA序列的由人工合成的与所要扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物,即左右端引物.此引物范围须包括所欲扩增的DNA片段,一般需20~30个碱基对组成,过少则难保持与DNA单链结合.引物与互补DNA结合后,以靶DNA为模板,经单链杂交复性(退火如55℃、2分钟),此时,TaqDNA聚合酶催化四种底物(三磷酸脱氧核苷,即dNTP)按从5到3方向将引物延伸、自动合成新的DNA链,使DNA重新复制成双链.然后又开始第二次循环扩增.引物在反应中不仅起引导作用,而且起着特异地限制扩增DNA片段大小的作用.新合成的DNA链含有引物的互补序列,又可作为下一轮聚合反应的模板.如此反复地进行上述模板DNA加热变性模板DNA引物的复性这一个在DNA 聚合酶作用下的引物延伸循环过程,每次循环后延伸的模板又增加一倍、也就是扩增DNA产物一倍.经过反复循环,使得靶DNA得到大量的扩增.
PCR反应中所需的模板DNA的量极少(≥104 DNA分子),只要按常规方法从组织或细胞中提取染色体DNA即可用于PCR扩增反应.鉴别扩增产物是否确实为欲分离的目的基因,可直接进行DNA序列分析,这种鉴定步骤是极其重要的.应用PCR扩增可能会出现一定概率的错配(尽管PCR反应错配概率很低,0.25%),当欲扩增的DNA大至3kb~ 10kb时,扩增的准确性和效率会大大降低.所以建议仅在对较小片段的目的基因分离,扩增时采用PCR技术.在设计引物时,还可加入适当限制酶位点置于引物序列中、可以方便以后的分子生物学操作.PCR技术自从1988年正式推出后,迅速风靡于世,被广泛用于DNA酶促扩增,RNA酶促扩增,直接DNA序列测定,甚至对细胞内稀有DNA进行定量测定.但PCR技术也存在一些缺点:扩增DNA的长度一般不超过2kb,TaqDNA聚合酶在合成作用时也会发生错误,出错率0.25,费用比较昂贵.目前人们正在设法克服这些缺点、而发挥PCR技术的长处.
PCR技术上优点很多,具有快速,灵敏,简便,特异等特点.PCR对DNA模板的质量和数量要求比其他实验方法低得多,PCR技术可用来源于几根头发,贮存了一段时间的干血迹、精斑,或用石蜡包埋的组织等材料作为模板,它具有极灵敏的对DNA分子的分析和检测能力、能检测到单分子DNA或每10万个细胞仅含1个靶DNA分子的样品.所以PCR技术已广泛应用于传染病、遗传疾病检测诊断、肿瘤,癌基因的诊断和研究,基因工程的分子克隆等等很多领域中.
第四章DNA的指纹图与基因诊断基因工程技术的发展为人类定向改造生物提供了强有力的技术手段.我们可以在试管里对基因进行各种操作,改变它的结构,然后再转移到生物细胞里、从而可以培育出符合人类需要的新生物个体.这种对生物遗传信息的改变,只是基因工程技术应用的一个方面.
基因工程另外一个非常重要的用途、是检测生物遗传信息的存在,也就是测定某个样品中是否有某种基因存在,或者是对不同生物个体的基因的结构进行对比研究.这种检测遗传信息的技术,在人类工作,生活的许多方面开始得到大量应用.
一、DNA序列的指纹图特征每个人都有自己独特的指纹.从20世纪30年代开始,指纹就被用来识别个体,鉴别犯罪嫌疑人.DNA指纹图的概念是由英国遗传学家Alec Jeffreys提出来的.
生物的DNA是编码其遗传信息的纤维状大分子物质.不同生物的遗传性状不同、编码它们的遗传信息的DNA的结构也就不同.不同生物DNA,分子结构的差异主要表现在碱基排列顺序的不同上.不同种类的生物具有稳定而明显的差异,它们的DNA的结构也具有明显的差别、而且、亲缘关系越远,性状差别越大, DNA的结构差异也就越大.同一种生物的不同个体之间也存在明显差别、它们的DNA的结构也就有不同之处.
人基因组的DNA共有30亿个碱基对、不同的人其DNA序列的99.9 %都是一样的.但是0.1 %的差别就意味着不同的人其DNA序列中有300万个碱基对不一样.如果把人的基因组比喻成一本书,300万字的差别已经足以使不同的人演绎出非常不同的生命篇章了.
只要不是同卵双胞胎,那么,每一个人的DNA在结构上都有自己独有的,区别于地球上任何一个人的(包括过去生存过的人和将来要出生的人)序列特征.这种序列特征就像指纹一样是每个个体独有的.因此,利用DNA的结构特征可以对个体进行识别、就像可以用指纹识别个体一样.利用基因工程中的一些技术方法可以把不同生物个体的DNA的差异显示出来,这个过程被形象地称为制作DNA指纹图.
制作DNA指纹图的核心是把DNA在碱基排序方面的不同特点真实,形象地表现出来.最直截了当的方法莫过于对DNA进行序列测定,读出DNA样品的全部碱基序列,也就可以对不同样品的差异进行全面的比较.由于受DNA测序技术的限制以及DNA样品要求的不同、用全序列分析的方法进行DNA的鉴别往往难以办到,或者没有必要.
比较常用,而且已经很成熟的制作DNA指纹图的方法是利用限制性内切酶对序列的识别特点以及用PCR方法对特定DNA区段进行专一性扩增.
二、基因探针,印迹杂交与遗传病的产前诊断我们知道,镰刀形贫血病是由编码血红蛋白β链的基因有一个核苷酸发生突变引起的.如果这个镰刀形细胞基因是纯合的,病人就会表现出严重的贫血症状,寿命也会缩短很多.如果镰刀形细胞基因只有一个拷贝、另一个拷贝是正常的,病人只是缺陷基因的携带者.这种镰刀形基因的携带者一般不表现症状,甚至在恶性疟疾流行的地区还具有生存优势.
当父母双方都是镰刀形基因的携带者时,他们的后代中有14是正常基因纯合,14是镰刀形基因纯合,12是两种基因杂合.由于有14的可能性会得到镰刀形基因纯合的后代,就需要进行产前诊断、提前预测目前怀孕的胎儿是不是患有缺陷基因纯合症,以便采取合适的措施.
要实现对镰刀形贫血病的产前诊断、就要建立一种分析DNA结构差异的方法.这种方法必须可以对胎儿的基因型给出明确的诊断结论.如果能在怀孕的早期抽取部分羊水样品来分析胎儿的血红蛋白的基因型,就可以使镰刀形基因的携带者的父母做出合适的优生选择.
在基因工程领域本身就需要对某个生物细胞的DNA进行检测.例如,当我们把人的胰岛素基因转移到大肠杆菌细胞中后,我们需要用某种方法对工程菌的基因型进行分析,以便确证胰岛素基因是否转移成功.这种方法在基因工程发展的早期就由一位名叫Southern的科学家建立了起来.遗传病的产前诊断不过是这种技术在医学健康领域的应用罢了.
镰刀形基因的产物在β6位由缬氨酸替换了谷氨酸.这种氨基酸的替换是由于DNA密码子里的A被换成了T .这个密码子所处的区域存在一个CCTNAGG序列(N代表四个碱基中的任意一个),这个序列是限制性内切酶MstII的识别位点.当A被换成T以后,CCTNTGG就不能被MstII识别.这就意味着在镰刀形基因里少了一个MstII的切口.见图5.22所示.
正常的血红蛋白β链基因具有3个MstII识别位点.镰刀形基因由于碱基的变化失去了中间的那个MstII位点.如果用MstⅡ酶去切割带有镰刀形基因和正常人的基因组DNA时,会有一个片段不一样.这个片段只是几百万个可能得到的片段中的一个,如何识别出这个有差异的片段,无异于是大海捞针.
基因工程研究中发展的一种Southern印迹杂交技术为寻找和识别单个基因的差别奠定了基础.印迹杂交是由Southern建立的一种分析DNA样品中是否存在某个特定基因片段的方法.见图5.23所示、这种方法的过程如下:
首先,用限制性内切酶完全消化样品DNA.在我们讨论的例子中、用MstII酶分别消化镰刀形贫血病人和正常人的总DNA.由于人的基因组DNA非常庞大,MstII的识别位点很多,我们可能会得到数以百万计的切割片段.
第二步,把消化好的DNA样品在琼脂糖凝胶中进行电泳分离,DNA片段会按照分子大小在泳道上排布开.
第三步,把带着分离好的DNA片段的凝胶泡在碱性溶液里、 DNA分子就会变性,全部成为单链分子.
第四步,把一张与凝胶同样大小的纤维素膜或者尼龙膜覆盖在凝胶上,然后在上方加滤纸、通过毛细管作用,液体从凝胶里向滤纸里吸渗,凝胶里的DNA分子随着液流到达纤维素膜并被吸附和固定在膜上,这样,我们得到一张复制了的凝胶,也就是说,DNA在凝胶上的分离状态被拓印到了纤维素膜上.
第五步,合成DNA探针(或叫基因探针).把克隆的血红蛋白基因用放射性元素P32标记.探针DNA变性成单链分子,然后与纤维素膜上的单链DNA进行杂交.具体做法是把纤维素膜装在一个塑料袋里;里面加上缓冲液和基因探针,通过震摇使探针分子与膜上的DNA充分杂交.探针分子因为序列互补的关系可以与膜上的血红蛋白基因的:DNA结合,复性成为双链.这样,在膜上有目标DNA.即血红蛋白基因的位置上,带放射性的基因探针就被专一性地吸附,固定了上去.
第六步,在杂交后的纤维素膜上盖上X光胶片,经过一定时间的曝光后冲洗出胶片,就可以发现,在有血红蛋白基因的位置上出现深色条带.
正常的血红蛋白β链基因可以被MstII切割成1.1kb的片段,而镰刀形基因由于中间一个切割位点消失,因而被切割成1.3kb的片段.不同基因型的个人在印迹杂交图上表现的条带的数目,位置是不同的.正常人只有血红蛋白A,在印迹杂交图谱上其基因条带只有1.1kb的一条;镰刀形基因的携带者有一半是血红蛋白A,另一半是血红蛋白S ,其基因条带也有两条,1.1kb和1.3kb各一条;镰刀形贫血病患者体内只有血红蛋白S,其基因条带也只有1.3kb的一条.见图5,24所示.
因此,通过印迹杂交中目的基因DNA的位置,数目可以推断出病人的基因型,这样就可以达到准确诊断的目的.
这种方法叫做限制性片段长度多态性,英文简称RFLP.由于DNA碱基序列的不同、造成某种限制性内切酶对DNA切割位点的不同、因而、相近的DNA可能会被同一种酶切割成长度不等的片段.通过印迹杂交可以形象地把这种差别显示出来,从而达到基因诊断的目的.
这种方法具有通用性,可以用于任何需要对相近但有序列差异的DNA样品进行的分析和比较、用这种方法得到的反映DNA结构精细差异的印迹杂交图谱就被形象地称为DNA指纹图.
三、PCR与基因扩增PCR是英文聚合酶链式反应的缩写,这个技术是一种在很短的时间内把一个特定的DNA分子扩增几百万倍甚至几十亿倍的方法,它是美国科学家Kary Mullis的天才发明.这个技术的出现不仅大大简化了DNA克隆和测序过程,显著扩展了重组DNA技术的应用范围,而且开始在人类生活的诸多方面得到越来越多的直接应用.由于这项技术几乎改变了分子生物学研究与应用的各个方面,影响十分重大,发明者Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖.从1984年发明这项技术到:1:993年获诺贝尔奖相隔不过10年,一项技术在如此短的时间里得到科学界的认可,在诺贝尔奖的历史上也不多见.这是因为PCR技术诞生以后在各个方面的应用也像链式反应一样急剧扩展,才能在短时间里取得如此重要的地位.
PCR技术的发明人可以说是一个科学奇才、他是南加州人、一个狂热的冲浪运动爱好者.他在佐治亚理工大学获得化学学士学位、在加州大学波克立分校获得生物化学博士学位.他的博士学位论文题目如果直译出来就是分裂运动:结构与合成,他在论文中提出宇宙是处在正在消失的物质和正在膨胀的物质之间达成的平衡的状态.博士毕业后整个70年代在Cetus公司工作.
他关于PCR技术的最初灵感是在他驾驶本田车在高速公路上兜风时想出来的.他认为自己在驾车飞驰时灵感最丰富.这个伟大的灵感仅仅使Cetus公司给了他1万美元的报酬.他不安分的性格使他不愿意受到任何约束,他辞去了Cetus的工作,并且拒绝与任何生物技术机构或公司结合,成了一个自由职业者.现在,这位科学奇才一边周游世界;一边在宇宙学,玄学,数学,病毒学和人工智能等领域发表演讲和进行咨询.
聚合酶链式反应简单说就是在试管里模拟细胞合成DNA的过程,这是一种快速复制特定DNA片段的技术.进行PCR反应需要几个条件:①要有一对引物,引物是按照待扩增的DNA两边相邻的序列设计的,因此,要扩增某个DNA片段,这个区域上游和下游相邻的序列必须知道至少20-30个碱基对那么长;②要有带有待扩增DNA片段的样品作为被扩增的底物,底物样品中只要有1个待扩增DNA分子就可以了,样品主允许存在大量其他无关的DNA分子;⑧有四种脱氧三磷酸核苷(dNTPs);④有可以耐高温的DNA聚合酶,这种聚合酶最初是从美国黄石国家公园温泉里的耐热细菌里分离出来的,它在72℃时活性最好.
假如有一个DNA分子由ABCDE五个部分组成,它的两条链分别是abcde和abcde.假如我们需要把C区扩增出来,尽管C区的序列是未知的,但只要知道与它相邻的B和D的序列,就可以用PCR方法把C扩增出来.
首先,根据已知的序列用化学方法合成寡聚核苷酸引物b和d.把底物样品、引物,dNTPs ,DNA聚合酶以及缓冲液按照一定的比例加在试管里、就可以开始PCR了(见图5.25所示).
第一步,把反应液加热到95℃、引物和底物DNA都会变性成单链.
第二步,把温度降到54℃、DNA单链会按照碱基序列互补的原则复性成双链,由于引物的分子数量远远超过底物DNA分子的数量,引物b和d,就优先分别与底物的abcde链和abcde链中的b和d配对复性成双链.
第三步,把反应液的温度再提高到72℃.在高温DNA聚合酶的催化下,引物与底物的杂合双链会在引物的3端以底物链为模版开始延伸、合成出完整的双链DNA分子.这时,我们得到了2个包含C区的新的DNA分子.也就是说,经过这样一个变性-复性-延伸的三步曲,待扩增的目标DNA分子从1个变成了2个.
如果我们对反应液重复进行上述95℃一54℃一72℃的变温处理,第一轮新合成的2个目标DNA分子可以作为底物合成出4个新分子.第三轮的变温反应可以得到8个新目标DNA分子.依此类推,每一轮反应都可以使目标DNA分子数目扩增2倍.扩增n次后,目标DNA分子就从1个变成2n个.经20次循环,目标DNA被扩增100万倍;经30次循环,目标DNA被扩增10亿倍.经过20-30次扩增后,1个目标DNA分子可以增加到微克量级,用琼脂糖凝胶电泳等方法可以方便地检测到,也可以直接用来进行重组克隆和序列测定等工作.
四、DNA指纹图的应用RFLP与PCR技术结合为人类分析DNA的结构提供了强大的工具,用这些技术制作的DNA指纹图在与人类生活相关的诸多领域已经得到广泛的应用.
疾病临床诊断是DNA指纹图的个重要应用.是严重威胁人类健康的一种性传染病.过去是用免疫学方法通过检测抗体的存在来鉴别带毒者的,但是有一部分带毒者没有免疫反应、体内没有病毒抗体,用传统方法就会漏检、使他们继续把病毒传染给其他人.基于PCR的DNA指纹图技术可以直接检测病人体内的病毒DNA而不用关心是否有抗体产生,这样就可以尽早发现带毒者、对于切断传染途径十分重要.
从结核病人的样本中发现和诊断结核杆菌是非常麻烦和费事的.但是,如果利用PCR技术则可以在100万个细胞里检测到10个结核杆菌的存在,既快又准确.
癌症的发生往往是某些基因例如生长控制基因SRAS以及抑癌基因p53发生突变的结果,利用PCR技术监控这些基因结构的变化情况,可以实现对某些癌症的早期诊断、对癌症患者无疑是一大福音.
DNA指纹图技术用于个体的识别具有灵敏,准确的特点、因此,它已经像指纹一样在刑事侦察和法医鉴别中得到广泛应用.罪犯在现场留下的血迹、精斑甚至一根毛发都可以提供足够的DNA样品进行DNA指纹图分析,为鉴别罪犯提供了强有力的新工具.美国已经开始把各种犯罪嫌疑人的DNA指纹图存在电脑档案里为破案服务.1998年夏天,在佛罗里达的一个城市,有一个摩托车手在大街上飞驰而过,并顺口向地上吐了一口痰.在一旁巡逻的警员灵机一动,把痰迹采样送回警察局进行了DNA指纹图分析,结果发现这个摩托车手是一个正在被追捕的杀人犯.一个逍遥法外多时的罪犯就这样落入法网.
利用DNA指纹图可以实现对动物,植物以及微生物新品种的保护.研究人员花费很多心血培育的新品种很容易被别人盗用,有了DNA指纹图就可以很方便地对品种进行监控,一旦有人盗用,即可发现并采取法律措施,这在过去是无法做到的.
生物体死亡后,DNA往往可以继续存在很多年.科学家利用PCR技术从已有2 400多年历史的埃及木乃伊里扩增出DNA并进行了指纹图分析,这些结果有助于了解古代民族的迁徙,融合等规律.保存在琥珀化石里的距今3000万年前的昆虫的DNA也可以做DNA指纹图分析,通过与现在的昆虫DNA进行对比可以发现生物进化的规律.这种用分子生物学成果分析古老DNA的技术成为了门新的学科:分子考古学.
第五章PCR技术的特点PCR技术能够高效率的扩增靶DNA,实现了多年来的体外克隆增殖的梦想.PCR技术已广泛的应用于基因分离,核酸序列分析,遗传病和传染病诊断、肿瘤机制探查,考古学等领域.法医学应用PCR进行基因多态性研究也已成为个人识别与亲子鉴定的新手段.PCR技术有以下几个特点:
1,灵敏度高在PCR扩增中、微量模板DNA以指数级迅速增加,理论上可检出一个体细胞内的单拷贝基因及生物性检材中极微量的DNA,灵敏度极高,扩增产物可增加上百万倍.由于所需检材DNA量少,即使微量检材也能做多次重复检测.
2,特异性强PCR扩增的靶DNA是基因组内多态位点或决定性别的等位基因,针对性强、特异性强.引物是依据靶基因位点的侧翼序列设计的,因此引物退火与模板DNA结合后,PCR只能扩增位于两引物之间的DNA片段,即引物的特异性决定了扩增片段的特异性.
3,适用于降解的DNA检材PCR技术检测的多态片段一般较小(

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